Find en forsker – Københavns Universitet

Generation of a High Resistance in vitro Blood-Brain-Barrier Model and Investigations of Brain-to-Blood Glutamate Efflux

Publikation: Bog/antologi/afhandling/rapportPh.d.-afhandlingForskning

Blod-hjernebarrieren (blood-brain barrier, BBB) opretholder den generelle homeostase i hjernens væsker. BBB kan også spille en rolle i homeostasen for den eksitatoriske aminosyre, L-glutamat. In vitro modeller kan være effektive værktøjer til at få mekanistiske informationer om transcellulær transport. De fleste in vitro modeller mangler dog funktionelle tight junctions. Dette projekt indeholder to underprojekter med målene; etabler og karakteriser en BBB model bestående af endothelceller fra kalvehjerner dyrket i co-kultur med rotte astrocytter og undersøg, hvordan tight junction-proteiner bliver påvirkede af dyrkningsmedier med høj bufferkoncentration; karakteriser den transcellulære transport af L-glutamat og involveringen af excitatoriske aminosyre transportører (excitatory amino acid transporter, EAAT) og evaluer om BBB kan spille en rolle i hjernens L-glutamat-homeostase. In vitro modelln blev etableret og karakteriseret med hensyn til ekspression af endothel- og astrocytspecifikke proteiner og morfologi. Øget buffer koncentration i de sidste 3 dages dyrkning medførte en 100 – 300 % øgning af den transendothele elektriske modstand op til 1638  256  • cm2 og en nedsat mannitolpermeabilitet fra 3.20  2.7 • 10-6 cm • s-1 til 0.88  0.13 • 10-6 cm • s-1. Dette korrelerede med en øget claudin-5 ekspression, mens andre tight junction-proteiner ikke var påvirkede. De præcise mekanismer bag denne regulering er uklare, men pH-svingninger under dyrkningen kan have medført en nedregulering af claudin-5 ved en direkte påvirkning eller som en afledt konsekvens. mRNA ekspression af en række vigtige BBB markører blev bekræftet, og breat cancer resistance protein- og P-glycoprotein-ekspression blev vist funktionelt. EAAT-substraterne, L-aspartat, L-glutamat, men ikke D-aspartat udviste polariseret transport i blod-til-hjerne-retningen med en KM på 138 ± 49 µM og Jmax på 28 ± 3.1 pmol • min-1 • cm-2 for L-glutamat. D-aspartat akkumuleredes i co-kulturerne, når det blev tilsat den basolaterale side. EAAT-1 ekspression var konstant og ensartet i modellen og i friskt isolerede kapillærer, mens ekspressionen af EAAT-2 og -3 var uklar. L-glutamat blev opkoncentreret i endothelcellerne indenfor 5 minutter af basolateral tilsætning. Optaget blev hæmmet af en generel EAAT-hæmmer og udviste Michaelis-Menten kinetik med Vmax på 31 ± 6 pmol • cm-2 • min-1 og KM på 36 ± 25 µM. Resultaterne viser, at BBB kan deltage i L-glutamat-homeostases gennem en kombination af EAAT-medieret optag over den basolaterale membran og efflux over den apical membran via en ukendt transportør, muligvis efter intracellulær metabolisme.
OriginalsprogEngelsk
Udgivelses stedKøbenhavn
ForlagFaculty of Health Sciences, University of Copenhagen
Antal sider117
ISBN (Trykt)978-87-90233-23-5
StatusUdgivet - 2012

ID: 46891487